คุณเคยรู้สึกสับสนกับคําว่า "PCR" "RT-PCR" และ "qPCR" ในห้องทดลองไหม? ไม่ต้องกังวลนะ บทความนี้จะอธิบายความแตกต่างระหว่างเทคนิคเหล่านี้อย่างง่ายดายช่วยให้คุณนําการค้นคว้าของคุณไปใช้ได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น.
พีซีอาร์ หรือปฏิกิริยาเชือกโพลิเมเรซ ทํางานเหมือนเครื่องถ่ายภาพดีเอ็นเอ เทคนิคโมเลกุลชีววิทยาพื้นฐานนี้ คารี มัลลิส สร้างขึ้นมาผลิตหนังสือล้านๆ ถึงพันล้านๆ ฉบับในไม่กี่ชั่วโมงPCR สําคัญสําหรับการคลอนพันธุกรรม การเรียงลําดับ DNA การวินิจฉัยโรค และการใช้งานอื่นๆ อีกมากมาย
กระบวนการ PCR ประกอบด้วย 3 ขั้นตอนที่ซ้ําซ้ําที่ทําให้การขยาย DNA ได้อย่างคาดเดา:
หลังจาก 25-40 จังหวะ, DNA ที่กระตุ้นสามารถจินตนาการได้โดยใช้การใช้ไฟฟ้ากรองเจล agarose.
QPCR หรือ Real-Time PCR จะสร้างขึ้นจาก PCR ปกติ โดยการนําการตรวจจับแสงสว่างเข้าสู่การติดตามการขยายในเวลาจริงในขณะที่ปรับปริมาณปริมาณรุ่น DNA แรก
มีวิธีการตรวจจับแสงสว่างหลักสองวิธี:
เมตร qPCR ที่สําคัญคือค่า Ct (วาระขั้นต่ํา) หมายเลขวาระเมื่อแสงสว่างเกินขั้นต่ําที่กําหนดไว้ ค่า Ct ที่ต่ํากว่าแสดงถึงปริมาณความเข้มข้นของเทมปลาเริ่มต้นที่สูงกว่า
การใช้งานประกอบด้วย
PCR การถ่ายทอดกลับ (RT-PCR) แรกแปลง RNA เป็น DNA ที่สมบูรณ์แบบ (cDNA) โดยใช้ cDNA การถ่ายทอดกลับ, แล้วขยาย cDNA ผ่าน PCR มาตรฐาน.
RT-PCR ปริมาณในเวลาจริง (Real-Time Quantitative RT-PCR) ผสมผสานการถ่ายทอดกลับกับ qPCR เพื่อปริมาณระดับการแสดงออกของ RNA วิธีมาตรฐานทองนี้ถูกใช้อย่างแพร่หลายสําหรับ:
| ลักษณะ | PCR | qPCR | RT-PCR | RT-qPCR |
|---|---|---|---|---|
| แมปลง | ดีเอ็นเอ | ดีเอ็นเอ | RNA | RNA |
| เป้าหมาย | การขยายดีเอ็นเอ | การปรับปริมาณ DNA | RNA→cDNA→DNA | ปริมาณของ RNA |
| การตรวจพบ | อิเล็กทรอฟอเรซส์เจล | ฟลูเรสเซนซ์ | อิเล็กทรอฟอเรซส์เจล | ฟลูเรสเซนซ์ |
| ปริมาณ | ไม่ | ใช่ | ไม่ | ใช่ |
| การใช้งานหลัก | การลอกลอน การเรียงลําดับ | การวิเคราะห์การแสดงออก การวินิจฉัย | การตรวจพบไวรัส RNA | การศึกษาการแสดงออกของพันธุกรรม |
qPCR ต้องการพริมเมอร์และซอนด์ที่ออกแบบอย่างรอบคอบ เพื่อให้แน่ใจว่ามีความเฉพาะเจาะจง ความไม่สอดคล้องสามารถนําไปสู่ผลที่ผิด
เอนไซม์ที่แตกต่างกัน (เช่น AMV, M-MLV) มีความแตกต่างกันในความมั่นคงทางความร้อนและประสิทธิภาพ ซึ่งส่งผลกระทบต่อผลผลิต cDNA
การกระตุ้นที่ไม่เฉพาะเจาะจงสามารถลดลงได้อย่างน้อยโดยการปรับปรุงอุณหภูมิการเผาผลาญและพอลิเมเรซความซื่อสัตย์สูง
การเข้าใจความแตกต่างของเทคนิคโมเลกุลเหล่านี้ ทําให้นักวิจัยสามารถเลือกวิธีที่เหมาะสมกับความต้องการการทดลองเฉพาะของพวกเขา โดยการรับประกันผลที่แม่นยําและน่าเชื่อถือ
คุณเคยรู้สึกสับสนกับคําว่า "PCR" "RT-PCR" และ "qPCR" ในห้องทดลองไหม? ไม่ต้องกังวลนะ บทความนี้จะอธิบายความแตกต่างระหว่างเทคนิคเหล่านี้อย่างง่ายดายช่วยให้คุณนําการค้นคว้าของคุณไปใช้ได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น.
พีซีอาร์ หรือปฏิกิริยาเชือกโพลิเมเรซ ทํางานเหมือนเครื่องถ่ายภาพดีเอ็นเอ เทคนิคโมเลกุลชีววิทยาพื้นฐานนี้ คารี มัลลิส สร้างขึ้นมาผลิตหนังสือล้านๆ ถึงพันล้านๆ ฉบับในไม่กี่ชั่วโมงPCR สําคัญสําหรับการคลอนพันธุกรรม การเรียงลําดับ DNA การวินิจฉัยโรค และการใช้งานอื่นๆ อีกมากมาย
กระบวนการ PCR ประกอบด้วย 3 ขั้นตอนที่ซ้ําซ้ําที่ทําให้การขยาย DNA ได้อย่างคาดเดา:
หลังจาก 25-40 จังหวะ, DNA ที่กระตุ้นสามารถจินตนาการได้โดยใช้การใช้ไฟฟ้ากรองเจล agarose.
QPCR หรือ Real-Time PCR จะสร้างขึ้นจาก PCR ปกติ โดยการนําการตรวจจับแสงสว่างเข้าสู่การติดตามการขยายในเวลาจริงในขณะที่ปรับปริมาณปริมาณรุ่น DNA แรก
มีวิธีการตรวจจับแสงสว่างหลักสองวิธี:
เมตร qPCR ที่สําคัญคือค่า Ct (วาระขั้นต่ํา) หมายเลขวาระเมื่อแสงสว่างเกินขั้นต่ําที่กําหนดไว้ ค่า Ct ที่ต่ํากว่าแสดงถึงปริมาณความเข้มข้นของเทมปลาเริ่มต้นที่สูงกว่า
การใช้งานประกอบด้วย
PCR การถ่ายทอดกลับ (RT-PCR) แรกแปลง RNA เป็น DNA ที่สมบูรณ์แบบ (cDNA) โดยใช้ cDNA การถ่ายทอดกลับ, แล้วขยาย cDNA ผ่าน PCR มาตรฐาน.
RT-PCR ปริมาณในเวลาจริง (Real-Time Quantitative RT-PCR) ผสมผสานการถ่ายทอดกลับกับ qPCR เพื่อปริมาณระดับการแสดงออกของ RNA วิธีมาตรฐานทองนี้ถูกใช้อย่างแพร่หลายสําหรับ:
| ลักษณะ | PCR | qPCR | RT-PCR | RT-qPCR |
|---|---|---|---|---|
| แมปลง | ดีเอ็นเอ | ดีเอ็นเอ | RNA | RNA |
| เป้าหมาย | การขยายดีเอ็นเอ | การปรับปริมาณ DNA | RNA→cDNA→DNA | ปริมาณของ RNA |
| การตรวจพบ | อิเล็กทรอฟอเรซส์เจล | ฟลูเรสเซนซ์ | อิเล็กทรอฟอเรซส์เจล | ฟลูเรสเซนซ์ |
| ปริมาณ | ไม่ | ใช่ | ไม่ | ใช่ |
| การใช้งานหลัก | การลอกลอน การเรียงลําดับ | การวิเคราะห์การแสดงออก การวินิจฉัย | การตรวจพบไวรัส RNA | การศึกษาการแสดงออกของพันธุกรรม |
qPCR ต้องการพริมเมอร์และซอนด์ที่ออกแบบอย่างรอบคอบ เพื่อให้แน่ใจว่ามีความเฉพาะเจาะจง ความไม่สอดคล้องสามารถนําไปสู่ผลที่ผิด
เอนไซม์ที่แตกต่างกัน (เช่น AMV, M-MLV) มีความแตกต่างกันในความมั่นคงทางความร้อนและประสิทธิภาพ ซึ่งส่งผลกระทบต่อผลผลิต cDNA
การกระตุ้นที่ไม่เฉพาะเจาะจงสามารถลดลงได้อย่างน้อยโดยการปรับปรุงอุณหภูมิการเผาผลาญและพอลิเมเรซความซื่อสัตย์สูง
การเข้าใจความแตกต่างของเทคนิคโมเลกุลเหล่านี้ ทําให้นักวิจัยสามารถเลือกวิธีที่เหมาะสมกับความต้องการการทดลองเฉพาะของพวกเขา โดยการรับประกันผลที่แม่นยําและน่าเชื่อถือ
