บล็อก เกี่ยวกับ คู่มือสําหรับ PCR เทคนิค RTPCR และ Qpcr อธิบาย

คุณเคยรู้สึกสับสนกับคําว่า "PCR" "RT-PCR" และ "qPCR" ในห้องทดลองไหม? ไม่ต้องกังวลนะ บทความนี้จะอธิบายความแตกต่างระหว่างเทคนิคเหล่านี้อย่างง่ายดายช่วยให้คุณนําการค้นคว้าของคุณไปใช้ได้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น.

พีซีอาร์ หรือปฏิกิริยาเชือกโพลิเมเรซ ทํางานเหมือนเครื่องถ่ายภาพดีเอ็นเอ เทคนิคโมเลกุลชีววิทยาพื้นฐานนี้ คารี มัลลิส สร้างขึ้นมาผลิตหนังสือล้านๆ ถึงพันล้านๆ ฉบับในไม่กี่ชั่วโมงPCR สําคัญสําหรับการคลอนพันธุกรรม การเรียงลําดับ DNA การวินิจฉัยโรค และการใช้งานอื่นๆ อีกมากมาย

กระบวนการ PCR ประกอบด้วย 3 ขั้นตอนที่ซ้ําซ้ําที่ทําให้การขยาย DNA ได้อย่างคาดเดา:

1. การลดธรรมชาติ:อุณหภูมิสูง (94-98°C) จะแยก DNA ใยสองเป็นใยเดียว
2. การผสมผสานการลดอุณหภูมิ (50-65 °C) ทําให้พริมเตอร์สามารถผูกกับลําดับเป้าหมายที่สมบูรณ์แบบได้
3. ขยาย:DNA polymerase (โดยทั่วไป Taq polymerase) ทําสังเคราะห์เชื้อใหม่ที่สมบูรณ์แบบที่ 72 °C

หลังจาก 25-40 จังหวะ, DNA ที่กระตุ้นสามารถจินตนาการได้โดยใช้การใช้ไฟฟ้ากรองเจล agarose.

QPCR หรือ Real-Time PCR จะสร้างขึ้นจาก PCR ปกติ โดยการนําการตรวจจับแสงสว่างเข้าสู่การติดตามการขยายในเวลาจริงในขณะที่ปรับปริมาณปริมาณรุ่น DNA แรก

มีวิธีการตรวจจับแสงสว่างหลักสองวิธี:

• สารสีที่ผูกพันธุ์ DNA (เช่น สีเขียว SYBR):คุ้มค่า แต่ไม่เฉพาะเจาะจง เชื่อม DNA ทั้งหมด
• โซนฟลอเรสเซ็นต์:เป้าหมายเฉพาะ แต่แพงกว่า ต้องการเครื่องสํารวจที่ออกแบบมาตามต้องการ

เมตร qPCR ที่สําคัญคือค่า Ct (วาระขั้นต่ํา) หมายเลขวาระเมื่อแสงสว่างเกินขั้นต่ําที่กําหนดไว้ ค่า Ct ที่ต่ํากว่าแสดงถึงปริมาณความเข้มข้นของเทมปลาเริ่มต้นที่สูงกว่า

การใช้งานประกอบด้วย

• การวิเคราะห์การแสดงออกของพันธุกรรม
• การตรวจพบเชื้อโรค
• การคัดกรองยา
• การวิจัยโรคมะเร็ง

PCR การถ่ายทอดกลับ (RT-PCR) แรกแปลง RNA เป็น DNA ที่สมบูรณ์แบบ (cDNA) โดยใช้ cDNA การถ่ายทอดกลับ, แล้วขยาย cDNA ผ่าน PCR มาตรฐาน.

• การศึกษาการแสดงออกของพันธุกรรม
• การตรวจพบไวรัส RNA (ตัวอย่างเช่น HIV, ไวรัสไข้หวัดหวัดหวัด)
• การวิจัยโครงสร้าง/ฟังก์ชัน RNA

RT-PCR ปริมาณในเวลาจริง (Real-Time Quantitative RT-PCR) ผสมผสานการถ่ายทอดกลับกับ qPCR เพื่อปริมาณระดับการแสดงออกของ RNA วิธีมาตรฐานทองนี้ถูกใช้อย่างแพร่หลายสําหรับ:

• การวัดการแสดงออกของพันธุกรรมอย่างแม่นยํา
• การกําหนดปริมาณของ microRNA
• การศึกษา RNA ที่ไม่ใช้โค้ดนาน

qPCR ต้องการพริมเมอร์และซอนด์ที่ออกแบบอย่างรอบคอบ เพื่อให้แน่ใจว่ามีความเฉพาะเจาะจง ความไม่สอดคล้องสามารถนําไปสู่ผลที่ผิด

เอนไซม์ที่แตกต่างกัน (เช่น AMV, M-MLV) มีความแตกต่างกันในความมั่นคงทางความร้อนและประสิทธิภาพ ซึ่งส่งผลกระทบต่อผลผลิต cDNA

การกระตุ้นที่ไม่เฉพาะเจาะจงสามารถลดลงได้อย่างน้อยโดยการปรับปรุงอุณหภูมิการเผาผลาญและพอลิเมเรซความซื่อสัตย์สูง

การเข้าใจความแตกต่างของเทคนิคโมเลกุลเหล่านี้ ทําให้นักวิจัยสามารถเลือกวิธีที่เหมาะสมกับความต้องการการทดลองเฉพาะของพวกเขา โดยการรับประกันผลที่แม่นยําและน่าเชื่อถือ