บล็อก เกี่ยวกับ หลักการสำคัญและการแก้ไขปัญหาสำหรับชุดสกัดกรดนิวคลีอิก

การสกัดกรดนิวคลีอิกเป็นรากฐานของการทดลองทางชีววิทยาโมเลกุล อย่างไรก็ตาม เมื่อเผชิญกับชุดสกัดเชิงพาณิชย์ที่มีให้เลือกมากมาย นักวิจัยหลายคนพบว่าตนเองสับสน โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อต้องแก้ไขปัญหาผลลัพธ์ที่ไม่คาดคิด บทความนี้จะไขความลับของหลักการทางวิทยาศาสตร์ที่อยู่เบื้องหลังชุดสกัดกรดนิวคลีอิก พร้อมทั้งให้คำแนะนำในการแก้ไขปัญหาเชิงปฏิบัติเพื่อเปลี่ยนเทคนิคที่จำเป็นนี้จากการดำเนินการแบบ "กล่องดำ" ให้เป็นกระบวนการที่คาดการณ์ได้และมีประสิทธิภาพ

ชุดสกัดกรดนิวคลีอิกเชิงพาณิชย์ส่วนใหญ่ใช้เทคโนโลยีคอลัมน์หมุนเมมเบรนซิลิกา โดยมีห้าขั้นตอนสำคัญ: การแตกเซลล์ การจับกรดนิวคลีอิก การล้างและทำให้บริสุทธิ์ การทำให้แห้ง และการชะล้างสุดท้าย แต่ละขั้นตอนสร้างต่อจากขั้นตอนก่อนหน้า ซึ่งหมายความว่าความผิดพลาดใดๆ อาจส่งผลต่อการสกัดทั้งหมด

การแตกเซลล์ที่มีประสิทธิภาพเป็นขั้นตอนแรกที่สำคัญ สูตรบัฟเฟอร์การแตกเซลล์จะแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับว่ากำลังสกัด DNA หรือ RNA แต่โดยทั่วไปจะมีความเข้มข้นสูงของเกลือที่ทำให้เกิดความโกลาหลซึ่งมีวัตถุประสงค์สองประการ:

• การทำให้โปรตีนเสียสภาพ: เกลือเหล่านี้จะทำลายพันธะไฮโดรเจน แรงแวนเดอร์วาลส์ และอันตรกิริยาที่ไม่ชอบน้ำ ทำให้โปรตีน (รวมถึงนิวคลีเอส) ไม่เสถียรเพื่อป้องกันการเสื่อมสภาพของกรดนิวคลีอิก
• ส่งเสริมการจับกับซิลิกา: สารทำให้เกิดความโกลาหลจะแทนที่โมเลกุลของน้ำออกจากกรดนิวคลีอิก สร้างสภาวะที่เหมาะสมสำหรับการถ่ายโอนไปยังเมมเบรนซิลิกา

เกลือที่ทำให้เกิดความโกลาหลทั่วไป ได้แก่ กัวนิดีนไฮโดรคลอไรด์ กัวนิดีนไทโอไซยาเนต ยูเรีย และลิเทียมเปอร์คลอเรต สารลดแรงตึงผิว มักถูกเติมเพื่อช่วยในการละลายโปรตีนและการแตกเซลล์ ขึ้นอยู่กับชนิดของตัวอย่าง อาจมีการรวมเอนไซม์ด้วย โปรตีน K จะย่อยโปรตีนในสารเตรียมกรดนิวคลีอิกได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยเฉพาะอย่างยิ่งภายใต้สภาวะที่ทำให้เสียสภาพ Lysozyme เป็นเอนไซม์ทั่วไปอีกชนิดหนึ่ง แม้ว่ากิจกรรมของมันจะลดลงภายใต้สภาวะที่ทำให้เสียสภาพ

การสกัดพลาสมิดแตกต่างอย่างมากจากการแยก RNA หรือ DNA จีโนม ความแตกต่างที่สำคัญอยู่ที่การแยกพลาสมิด DNA ออกจาก DNA จีโนมก่อน การเติมเกลือที่ทำให้เกิดความโกลาหลทันทีจะปล่อย DNA ทุกชนิดโดยไม่เลือก ดังนั้น โปรโตคอลพลาสมิดมักจะแนะนำสารทำให้เกิดความโกลาหลหลังจากแตกเซลล์เบื้องต้น

นอกเหนือจากการแตกเซลล์แล้ว เกลือที่ทำให้เกิดความโกลาหลยังช่วยในการจับกรดนิวคลีอิกกับคอลัมน์ซิลิกา เอทานอล (หรือบางครั้งไอโซโพรพานอล) จะช่วยเพิ่มการจับนี้ คอลัมน์ซิลิกาประกอบด้วยเรซินที่จับ DNA หรือ RNA ได้อย่างเลือกสรร ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของเกลือและปัจจัยอื่นๆ กรดนิวคลีอิกที่ได้จะมีความบริสุทธิ์สูง เหมาะสำหรับการโคลนนิ่ง การจัดลำดับแบบยาว และการใช้งานอื่นๆ

ความเข้มข้นของเอทานอลมีความสำคัญ เอทานอลส่วนเกินจะตกตะกอนวัสดุที่เสื่อมสภาพและโมเลกุลขนาดเล็ก ส่งผลต่อการอ่านค่าการดูดกลืนแสง A260 เอทานอลไม่เพียงพออาจขัดขวางการกำจัดเกลือออกจากเมมเบรน ปริมาณเอทานอลที่ให้มาในชุดได้รับการปรับให้เหมาะสมแล้ว แต่หาก DNA ที่เสื่อมสภาพดูเหมือนจะทำให้ค่า A260 ผิดเพี้ยน การปรับความเข้มข้นของเอทานอลใหม่ก็อาจช่วยได้ สารละลายที่ไหลผ่านสามารถเก็บไว้เพื่อตกตะกอนเพื่อกู้คืนกรดนิวคลีอิกที่สูญเสียไป เมื่อใช้สารลดแรงตึงผิวที่มี SDS ในการแตกเซลล์ NaCl จะทำหน้าที่เป็นสารตกตะกอนที่มีประสิทธิภาพซึ่งหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของสารลดแรงตึงผิว

หลังจากปั่นสารละลายผ่านเมมเบรนซิลิกา กรดนิวคลีอิกเป้าหมายจะจับกับคอลัมน์ ในขณะที่โปรตีนและโพลีแซคคาไรด์ยังคงอยู่ในสารละลายที่ไหลผ่าน อย่างไรก็ตาม เมมเบรนจะเก็บโปรตีนและเกลือตกค้างไว้ ตัวอย่างพืชอาจทิ้งโพลีแซคคาไรด์และเม็ดสี ตัวอย่างเลือดมักจะทำให้เกิดสีน้ำตาลหรือสีเหลือง การล้างจะกำจัดสิ่งปนเปื้อนเหล่านี้

โดยทั่วไปจะมีการล้างสองครั้ง แม้ว่าจำนวนครั้งที่แน่นอนจะขึ้นอยู่กับชนิดของตัวอย่าง การล้างครั้งแรกมักจะมีสารทำให้เกิดความโกลาหลความเข้มข้นต่ำเพื่อกำจัดโปรตีนและเม็ดสีตกค้าง ตามด้วยการล้างด้วยเอทานอลเพื่อกำจัดเกลือ ตัวอย่างที่มีโปรตีนต่ำในตอนแรก (เช่น การเตรียมพลาสมิดหรือการทำให้ผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์) อาจต้องการเพียงการล้างด้วยเอทานอล การกำจัดสารทำให้เกิดความโกลาหลอย่างสมบูรณ์เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับผลผลิตและความบริสุทธิ์สูง ชุดบางชุดแนะนำให้ล้างด้วยเอทานอลสองครั้ง เกลือตกค้างจะยับยั้งการชะล้าง ทำให้ผลผลิตลดลงและเพิ่มค่า A230 ซึ่งทำให้ค่า A260/230 ลดลง

โปรโตคอลส่วนใหญ่รวมถึงการปั่นหลังการล้างเพื่อทำให้เอทานอลตกค้างออกจากคอลัมน์ ขั้นตอนนี้มีความสำคัญต่อการชะล้างที่สะอาด การเติมบัฟเฟอร์ Tris 10 มิลลิโมลาร์ หรือน้ำ จากนั้นจะทำให้กรดนิวคลีอิกกลับคืนสู่สภาพเดิมเพื่อปลดปล่อยออกจากเมมเบรน เอทานอลตกค้างจะป้องกันการกลับคืนสู่สภาพเดิมและการชะล้างอย่างสมบูรณ์ แม้ว่าเอทานอลจะไม่สามารถตรวจจับได้ด้วยสเปกโทรโฟโตเมตรี แต่สัญญาณที่บ่งชี้ ได้แก่ ตัวอย่างที่ไม่สามารถตกตะกอนลงในช่องเจลอะกาโรส (แม้จะมีสีย้อมสำหรับโหลดอยู่) หรือไม่สามารถแช่แข็งที่ -20 องศาเซลเซียสได้

ขั้นตอนสุดท้ายของการสกัด DNA คือการปลดปล่อยกรดนิวคลีอิกที่บริสุทธิ์ออกจากซิลิกา สำหรับ DNA, Tris 10 มิลลิโมลาร์ ที่ pH 8-9 เป็นมาตรฐาน DNA จะมีความเสถียรมากขึ้นใน pH ที่เป็นด่างอ่อนๆ และละลายได้เร็วกว่าในบัฟเฟอร์มากกว่าน้ำ แม้แต่ตะกอน DNA ก็มีพฤติกรรมคล้ายกัน น้ำมักจะมี pH ต่ำกว่า (4-5) และ DNA ที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูงอาจไม่กลับคืนสู่สภาพเดิมอย่างรวดเร็ว เพื่อให้ได้ผลผลิต DNA สูงสุด ให้ปล่อยให้บัฟเฟอร์อยู่บนเมมเบรนเป็นเวลาหลายนาที ก่อนการปั่น สำหรับการใช้งานที่ต้องการ DNA ที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูงและสมบูรณ์ (เช่น การจัดลำดับแบบยาว) บัฟเฟอร์ชะล้างจะเหมาะสมที่สุด RNA ทนต่อ pH ที่เป็นกรดอ่อนๆ และละลายได้ง่ายในน้ำ ทำให้เป็นตัวทำละลายที่นิยม

แม้จะปฏิบัติตามโปรโตคอลมาตรฐาน การสกัดก็อาจพบปัญหาต่างๆ ได้:

• ผลผลิตต่ำ: มักเกิดจากการแตกเซลล์ไม่สมบูรณ์หรือสภาวะการจับที่ไม่เหมาะสม ควรใช้เอทานอลปราศจากน้ำที่สดใหม่และมีคุณภาพสูงเสมอสำหรับการเจือจางบัฟเฟอร์และขั้นตอนการจับ เอทานอลคุณภาพต่ำหรือเก่าอาจดูดซับความชื้น ทำให้ความเข้มข้นในการทำงานเปลี่ยนแปลงไป โปรดจำไว้ว่า - บัฟเฟอร์ล้างที่เตรียมไม่ถูกต้องอาจชะล้างกรดนิวคลีอิกที่สกัดออกไป!
• ความบริสุทธิ์ต่ำ: การปนเปื้อนโปรตีนมักเกิดจากปริมาณเริ่มต้นมากเกินไป ทำให้ความเสี่ยงในการละลายไม่สมบูรณ์เพิ่มขึ้น ค่า A260/230 ต่ำมักบ่งชี้ถึงเกลือตกค้างหรือการล้างไม่เพียงพอ ใช้เอทานอลคุณภาพสูงสุดสำหรับบัฟเฟอร์ล้าง และหากปัญหายังคงอยู่ ให้เพิ่มขั้นตอนการล้างพิเศษ
• สิ่งปนเปื้อน: ตัวอย่างสิ่งแวดล้อมมีความอ่อนไหวต่อสารฮิวมิกที่ปนเปื้อนกับ DNA และทนต่อการกำจัดด้วยคอลัมน์ซิลิกา เทคนิคพิเศษสามารถกำจัดโปรตีนและสารฮิวมิกที่รบกวนก่อนการจับกับคอลัมน์
• การเสื่อมสภาพ: RNA มีความเสี่ยงต่อการเสื่อมสภาพมากกว่า โดยทั่วไปเกิดจากการเก็บตัวอย่างไม่ถูกต้องหรือการแตกเซลล์ที่ไม่มีประสิทธิภาพ (โดยสมมติว่าใช้น้ำปราศจาก RNase) สำหรับ DNA การเสื่อมสภาพมีความสำคัญน้อยกว่าสำหรับการใช้งาน PCR แต่มีความสำคัญอย่างยิ่งสำหรับการจัดลำดับแบบยาวที่ต้องการ DNA ที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูงและสมบูรณ์ - หลีกเลี่ยงการแตกเซลล์ด้วยเครื่องจักรที่มากเกินไป!
• การทำให้ผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์: แม้ว่าจะไม่ใช่การสกัด DNA โดยตรง แต่ก็ควรกล่าวถึง โดยทั่วไปจะเติมสารละลายเกลือ 3-5 ปริมาตรต่อปริมาตรของปฏิกิริยา PCR ก่อนการทำให้บริสุทธิ์ด้วยคอลัมน์หมุน การทำให้บริสุทธิ์ที่ล้มเหลวมักเกิดจาก PCR ที่ล้มเหลว แต่การเก็บสารละลายที่ไหลผ่านไว้ก็เป็นสิ่งที่ดี - หากแถบ PCR ที่ชัดเจนไม่จับกับคอลัมน์ ก็มีแนวโน้มที่จะยังคงอยู่ในสารละลายที่ไหลผ่านเพื่อกู้คืนและทำให้บริสุทธิ์อีกครั้ง

การแตกเซลล์ไม่สมบูรณ์อาจแสดงออกมาในรูปของผลผลิตที่ต่ำกว่าที่คาดไว้ การละลายโปรตีนไม่สมบูรณ์ หรืออัตราส่วน A260/230 ที่ต่ำ สิ่งเหล่านี้บ่งชี้ว่าส่วนประกอบของตัวอย่างบางส่วนไม่สามารถแตกเซลล์หรือละลายได้อย่างสมบูรณ์ระหว่างการสกัด การแยกความแตกต่างระหว่างการแตกเซลล์ไม่สมบูรณ์กับสิ่งปนเปื้อนหรือการเสื่อมสภาพต้องอาศัยการวิเคราะห์สภาวะการสกัดอย่างรอบคอบ รวมถึงองค์ประกอบของบัฟเฟอร์การแตกเซลล์ พารามิเตอร์การบ่ม และสารที่อาจรบกวน ตัวอย่างเช่น อัตราส่วน A260/230 ที่ต่ำอาจบ่งชี้ถึงเกลือตกค้างหลังการจับ หรือการล้างไม่เพียงพอ แทนที่จะเป็นการแตกเซลล์ไม่สมบูรณ์ การแก้ไขปัญหาการแตกเซลล์ไม่สมบูรณ์อาจต้องปรับปรุงส่วนประกอบของบัฟเฟอร์การแตกเซลล์ ระยะเวลาบ่ม หรือการรวมวิธีการแตกเซลล์ด้วยเครื่องจักร/เอนไซม์เพิ่มเติม

เทคนิคพิเศษมุ่งเป้าไปที่การกำจัดสารฮิวมิกและสารรบกวนอื่นๆ ที่อาจปนเปื้อนกับกรดนิวคลีอิกจากตัวอย่างสิ่งแวดล้อม สิ่งเหล่านี้รวมถึงบัฟเฟอร์สกัดพิเศษที่มีสารคีเลต (เช่น EDTA) เพื่อจับและกำจัดไอออนบวกได้อย่างเลือกสรร วิธีการบำบัดเบื้องต้น เช่น การปั่นแยกแบบแยกส่วน หรือการกรอง สามารถช่วยกำจัดอนุภาคขนาดใหญ่จากตัวอย่างสิ่งแวดล้อมก่อนการสกัดกรดนิวคลีอิก ลดการรบกวนระหว่างขั้นตอนการจับ

ตัวอย่างบางชนิด (เช่น เนื้อเยื่อหรือวัสดุที่มีไขมันสูง) ก่อให้เกิดความท้าทายเฉพาะ ตัวอย่างเนื้อเยื่อมักต้องการการรบกวนทางกลเพิ่มเติม หรือการย่อยด้วยเอนไซม์เพื่อให้แน่ใจว่ามีการแตกเซลล์และการปลดปล่อยกรดนิวคลีอิกอย่างสมบูรณ์ ตัวอย่างที่มีไขมันสูงอาจทำให้การทำให้บริสุทธิ์ซับซ้อนขึ้น เนื่องจากไขมันสามารถรบกวนการจับกรดนิวคลีอิกกับเมทริกซ์ของคอลัมน์ การแก้ไขความท้าทายเหล่านี้อาจต้องมีการปรับเปลี่ยนองค์ประกอบของบัฟเฟอร์การแตกเซลล์ การปรับโปรโตคอลการทำให้บริสุทธิ์ให้เหมาะสม หรือการใช้ชุดที่ออกแบบมาเป็นพิเศษ

เผยแพร่ครั้งแรกเมื่อวันที่ 28 มิถุนายน 2010 ตรวจทานและเผยแพร่ซ้ำในเดือนพฤษภาคม 2021 และมีนาคม 2024.