QPCR และ Real-Time PCR เป็นเครื่องมือพื้นฐานในชีววิทยาโมเลกุล แต่ความสับสนยังคงเกิดขึ้นเกี่ยวกับความแตกต่างและการใช้งานของพวกเขาคู่มือที่ครบถ้วนนี้อธิบายเทคนิคเหล่านี้ในขณะที่สํารวจแนวปฏิบัติที่ดีที่สุดเพื่อได้รับผลการทดลองที่น่าเชื่อถือ.
qPCR vs PCR ในเวลาจริง: การชี้แจงแนวคิด
ขณะที่มักจะใช้กันแทนกัน qPCR และ Real-Time PCR แสดงถึงด้านต่าง ๆ ของเทคโนโลยีเดียวกัน:
-
PCR ในเวลาจริงเน้นการติดตามในเวลาจริงของการขยาย DNA ผ่านการตรวจจับแสงสว่าง
-
qPCRโดยเฉพาะเจาะจงเน้นการวิเคราะห์ปริมาณของกรดนิวเคลียน เพื่อกําหนดปริมาณความเข้มข้นของตัวแบบเริ่มต้น
เทคนิคทั้งสองได้ปฏิวัติการวินิจฉัยโมเลกุล โดยทําให้นักวิจัยสามารถติดตามการขยายเสียงเมื่อมันเกิดขึ้น โดยกําจัดความจําเป็นในการใช้ไฟฟ้าเจลหลังการขยายเสียง
ค่า Ct vs. Cq: คําศัพท์อธิบาย
วงจรขั้นต่ําเป็นพารามิเตอร์สําคัญในการวิเคราะห์ปริมาณ:
-
Ct (รอบขั้นต่ํา): คําศัพท์ประเพณีที่แสดงหมายเลขวงจรเมื่อแสงสว่างเกินระดับพื้นหลัง
-
Cq (วินิจฉัยระยะ): คําศัพท์ที่ทันสมัยที่สะท้อนความแม่นยําของธรรมชาติปริมาณของการวัด
ค่า Ct/Cq ที่ต่ํากว่าแสดงถึงปริมาณปริมาณปริมาณปริมาณปริมาณปริมาณปริมาณปริมาณปริมาณปริมาณปริมาณปริมาณปริมาณปริมาณ
การพิจารณาด้านการออกแบบ Primer
ขณะที่หลักการ PCR มาตรฐานใช้ได้ qPCR ต้องการความต้องการการเริ่มต้นที่เข้มงวดกว่า
แนวทางทั่วไป
- ความยาวของคู่ฐาน 18-25
- เนื้อหา GC 40-60%
- อุณหภูมิการละลาย 60-65 °C
- การสร้างโครงสร้างรองอย่างน้อย
qความต้องการเฉพาะเจาะจงของ PCR
- ความเหมาะสมของซองสําหรับการวัดที่ใช้ซอง
- ความเฉพาะเจาะจงที่เพิ่มขึ้นเพื่อลดการผูกพันที่ไม่ตรงเป้าหมายให้น้อยที่สุด
- ตําแหน่งที่ปรับปรุงให้ดีที่สุด เพื่อป้องกันการสร้างไพรเมอร์-ไดเมอร์
ข้อดีเหนือจาก PCR ปรกติ
พีซีอาร์ในเวลาจริงนําเสนอการปรับปรุงอย่างสําคัญในการวิเคราะห์โมเลกุล
- การปรับปริมาณอย่างแม่นยํา โดยไม่ต้องแปรรูปหลัง PCR
- ความรู้สึกในการตรวจจับจนถึงตัวเลขสําเนาเดียว
- รูปแบบหลอดปิดลดความเสี่ยงของการติดเชื้อ
- ระยะทางไดนามิกกว้างถึง 7-8 ระดับขนาด
- ความสามารถในการ multiplexing สําหรับการตรวจจับเป้าหมายพร้อมกัน
สเปคเตอร์เทคโนโลยี PCR
รุ่น PCR ที่ทันสมัยให้บริการความต้องการการวิจัยที่แตกต่างกัน
PCR แบบปกติ
การตรวจพบจุดปลายสําหรับการวิเคราะห์คุณภาพโดยใช้กลีฟไฟฟ้า
PCR ปริมาณ (qPCR/PCR ในเวลาจริง)
การติดตามเคลื่อนไหวที่ทําให้สามารถกําหนดปริมาณได้อย่างแม่นยํา ผ่านการตรวจจับแสงสว่าง
PCR ดิจิตอล (dPCR)
การปรับปริมาณโดยสิ้นเชิงผ่านการจํากัดการละลายและสถิติ Poisson การกําจัดความต้องการเส้นโค้งมาตรฐาน
เทคนิคการเปรียบเทียบ: พีซีอาร์ที่หลุมรวมกับ พีซีอาร์ในเวลาจริง
แนวทางเหล่านี้ตอบโจทย์กับโจทย์ทดลองที่แตกต่างกัน
-
พีซีอาร์ที่รวมกันเสริมความเฉพาะด้วยการขยายลําดับด้วย 2 ชุดของพรีเมอร์
-
PCR ในเวลาจริงให้ข้อมูลปริมาณตลอดกระบวนการขยาย
หลักเกณฑ์การเลือกเครื่องมือ
ปัจจัยสําคัญสําหรับการทํางานของระบบที่ดีที่สุด ได้แก่
- ความจุของตัวอย่าง
- ความรู้สึกในการตรวจจับและช่วงความแรง
- การตั้งค่าทางแสงสําหรับการวัด multiplex
- ความเหมือนกันทางความร้อนและความเร็วในการจักรยาน
- ความสามารถของโปรแกรมวิเคราะห์ข้อมูล
การ ใช้ ใน ทุก สาขา วิชา
PCR ระยะเวลาจริง มีการใช้งานทางวิทยาศาสตร์และทางคลินิกที่หลากหลาย:
- การกําหนดรายละเอียดการแสดงออกของพันธุกรรมในการวิจัย
- การตรวจพบเชื้อโรคและการกําหนดจํานวนของไวรัส
- การวิเคราะห์การกลายพันธุ์ของ oncogene ในการวินิจฉัยมะเร็ง
- การศึกษาทางการแพทย์ในการพัฒนายา
- การตรวจพบ GMO ในผลิตภัณฑ์การเกษตร
- การวิเคราะห์ทางวิทยาศาสตร์และการทดสอบพันธุกรรม
เทคโนโลยีนี้ยังคงพัฒนาต่อไป ด้วยนวัตกรรมใหม่ในสารเคมีเครื่องตรวจ, เครื่องมือ, และวิธีการวิเคราะห์ข้อมูลการยกระดับตําแหน่งของมันเป็นเครื่องมือที่จําเป็นในด้านวิจัยวิทยาศาสตร์ชีวภาพและการวินิจฉัยโมเลกุล.
Thai
