บล็อก เกี่ยวกับ พีซีอาร์ในเวลาจริงหลายแบบ พัฒนาประสิทธิภาพการวิจัย

ผิดหวังกับโปรโตคอล PCR ที่ยากลําบาก จํากัดด้วยปริมาณตัวอย่างที่คุ้มค่าสังคมวิทยาศาสตร์ตอนนี้กําลังยึดถือเทคโนโลยี multiplex real-time PCR.

เครื่อง สําเนา โมเลกุล: จาก mRNA เป็น Amplicons

หลักของมันคือปฏิกิริยาเชือกพอลิมเมเรซ (PCR) เป็นเครื่องถ่ายสําเนาของชีววิทยากระบวนการโดยทั่วไปเริ่มด้วยการสกัด mRNA จากตัวอย่างชีวภาพ, ตามด้วยการถ่ายทอดกลับเป็น DNA คอมพลิเมนเตอรี่ที่มั่นคงมากขึ้น (cDNA) cDNA นี้จึงกลายเป็นแบบจําลองสําหรับการขยาย PCR ผ่าน 3 ขั้นตอนวงจร:

• การลดธรรมชาติ:การแยก DNA double helix ด้วยอุณหภูมิสูง (90°C+)
• การผสมผสานการลดอุณหภูมิ (50~60°C) ทําให้การผูกพันของพิมพ์
• ขยาย:การทําความร้อนอย่างปานกลาง (70~78°C) สําหรับการสังเคราะห์ DNA โดยพอลีเมเรซ

PCR แบบดั้งเดิมพึ่งพาการใช้ไฟฟ้าเคลียร์เจลในการวิเคราะห์จุดสิ้นสุด ในขณะที่ PCR แบบที่ผ่านมา ภายในเวลาจริง นํามาติดตามแสงสว่างอย่างต่อเนื่องระหว่างการขยายเสียง

ความก้าวหน้าทางปริมาณ: ไดนามิกของ PCR ในเวลาจริง

PCR ระยะเวลาจริง (qRT-PCR) ได้ปฏิวัติการวิเคราะห์กรดนิวเคลียน โดยทําให้มีการขยายและปรับปริมาณพร้อมกันผ่านการตรวจจับแสงสว่าง

• สารสีที่ระดม(ตัวอย่างเช่น SYBR สีเขียว) ที่มีแสงสว่างเมื่อผูกกับ DNA สายสอง
• โซนด์เฉพาะเรียงลําดับด้วยระบบดับฟลูโฟร์ที่ทํางานเมื่อเป้าหมาย hybridization

เทคโนโลยีนี้ได้กลายเป็นสิ่งจําเป็นสําหรับการศึกษาระบบโรคของจุลินทรีย์ และการวิจัยด้านจุลินทรีย์พื้นฐานการให้การคณิตประเมินแบบสมบูรณ์แบบ (สําเนาโมเลกุล) หรือการวัดเฉลี่ยกับพันธุกรรมมาตรฐาน.

พีซีอาร์หลายแบบ: การประมวลผลคู่เคียงสําหรับการวิเคราะห์โมเลกุล

พีซีอาร์หลายแบบเป็นการกระโดดกระโดดทางวิวัฒนาการ โดยทําให้การขยายตัวของเป้าหมายหลายอย่างพร้อมกันผ่านชุดพิมพ์ที่ออกแบบอย่างละเอียด

• การอนุรักษ์ตัวอย่างที่หายาก
• การลดการบริโภค reagent
• กําหนดเวลาในการทดลองที่เร่งรัด
• การตีความข้อมูลที่เรียบง่าย

แต่เทคนิคนี้ต้องการการปรับปรุงเงื่อนไขปฏิกิริยาอย่างละเอียด เพื่อให้มีประสิทธิภาพการขยายที่เท่าเทียมกันในทุกเป้าหมายและองค์ประกอบของพัฟเฟอร์.

จุดสูงสุด: PCR ระยะเวลาจริงหลายแบบ

โดยการบูรณาการการประมวลผลคู่กันของ multiplex PCR กับความสามารถในการปรับปริมาณของ PCR ในเวลาจริง นักวิจัยได้รับเครื่องมือที่ไม่มีคู่แข่งสําหรับการวิเคราะห์พันธุกรรมที่มีผลผลิตสูงการนําเสนอเทคโนโลยีรวม:

• การตรวจจับเป้าหมายหลายแบบ
• การติดตามการเคลื่อนไหวในเวลาจริง
• การวัดปริมาณที่แม่นยํา

ปัญหาทางเทคนิคยังคงมีอยู่ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในเรื่องของการผสมผสานสายสีระหว่างเครื่องถ่ายแสงสว่าง เครื่องมือที่ทันสมัยและสารเคมีสีที่เชี่ยวชาญทําให้สามารถกําหนดปริมาณได้อย่างแม่นยําถึงหลายสิบเป้าหมายต่อปฏิกิริยา.

การใช้งานในสาขาวิชาชีววิทยา

ตั้งแต่เริ่มต้นในปี 1988 การทดลอง PCR multiplex ได้เปลี่ยนแปลงหลายสาขา:

• การสร้างพันธุกรรม:การวิเคราะห์คู่ ๆ ของ SNPs และดาวเทียมเล็ก ๆ
• การตรวจพบเชื้อโรค:การตรวจคัดกรองเชื้อโรคอย่างครบถ้วน
• การระบุ GMO:การทดสอบความปลอดภัยทางการเกษตรและอาหาร
• การกําหนดรายละเอียดการกลายพันธุ์การวิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงพันธุกรรม
• การศึกษาการแสดงออกการปรับปริมาณโตรังสคริปทอม

ข้อ สําคัญ ของ การ ปรับปรุง

การดําเนินการอย่างสําเร็จต้องให้ความสนใจอย่างละเอียดกับปริมาตรสําคัญห้าประการ

1. การออกแบบแบบเบอร์:ค่า Tm ที่สมดุล ลดโครงสร้างรอง
2. การเลือกซอนด์:ฟลูโรฟอร์ที่ไม่ซ้อนกัน พร้อมเครื่องดับไฟที่เหมาะสม
3. ระบบเอนไซม์:โพลิเมเรซส์ความซื่อสัตย์สูงที่มีพัฟเฟอร์ที่ปรับปรุงให้ดีที่สุด
4. ระบบจักรยานความร้อน:ปริมาตรการผสมผสาน/ขยายที่เหมาะสม
5. ประกอบปฏิกิริยา:คอนเซ็นทรัสการเบรมเกอร์/ซอนด์ที่สมดุล

มุมมองในอนาคต

ทะเลทางของเทคโนโลยีชี้วัดไปสู่การวินิจฉัยทางคลินิกที่ขยาย (รวมถึงการระบุโปรไฟลความต้านทานต่อยาต้านเชื้อ), โปรโตคอลความปลอดภัยอาหารที่พัฒนาขึ้น และระบบการติดตามสิ่งแวดล้อมที่ก้าวหน้าในขณะที่อุปกรณ์ปรับปรุงขัดขวางลดลงด้วยเครื่องมือการออกแบบคอมพิวเตอร์และระบบ reagent ที่ดีขึ้น, พีซีอาร์ในเวลาจริงหลายแบบ พร้อมที่จะกลายเป็นมาตรฐานทองสําหรับการวิเคราะห์โมเลกุลที่มีประสิทธิภาพสูง