หาก PCR ปกติใช้เป็น "กระจกขนาดใหญ่" ของชีววิทยาโมเลกุล แล้ว PCR ปริมาณในเวลาจริง (qPCR) จะใช้เป็น "ไมโครสโกปความแม่นยํา"เทคโนโลยีที่ทันสมัยนี้ไม่เพียงแค่ขยายลําดับพันธุกรรมเป้าหมาย แต่ยังติดตามกระบวนการขยายในเวลาจริง, ทําให้สามารถกําหนดระดับการแสดงออกของยีนได้อย่างแม่นยําการเปลี่ยนจากการประเมินค่อนข้างค่อนข้างค่อนข้างค่อนข้างค่อนข้างค่อนข้างค่อนข้างค่อนข้างค่อนข้างค่อนข้างค่อนข้างค่อนข้างค่อนข้างค่อนข้างค่อนข้างค่อนข้างค่อนข้างค่อนข้าง.
การปฏิกิริยาเชือกโพลิมเมเรซ (PCR) เป็นเทคนิคที่ปฏิวัติในชีววิทยาโมเลกุล ใช้โปรเมอร์โอลิกอนิวเคลียติดที่เฉพาะลําดับ โพลิมเมเรซ DNA ที่ทนความร้อนและการหมุนเวียนทางอุณหภูมิที่แม่นยํา เพื่อการจําลองเรียงลําดับ DNA หรือ cDNA, การบรรลุการขยายเสียงเป็นล้านเท่า Traditional endpoint PCR requires post-reaction detection and quantification through gel electrophoresis and image analysis—a time-consuming process with limited precision that struggles to meet growing demands for quantitative analysis.
QPCR ระยะเวลาจริงได้เปลี่ยนทัศนคตินี้ โดยการติดตามการผลิตผลิตภัณฑ์ ระหว่างแต่ละวัฏจักร PCR โดยการติดตามระยะการขยายตัวนักวิจัยสามารถกําหนดปริมาณเรียงลําดับเป้าหมายเบื้องต้น ด้วยความแม่นยําที่พิเศษขณะที่ PCR ในทฤษฎีจะเพิ่มมอลเลกุลเป้าหมายเป็นสองเท่าในแต่ละวงจร แต่การพยายามในช่วงต้นๆในการปรับปริมาณวัสดุเริ่มต้นผ่านการนับวงจรและการวัดผลิตภัณฑ์จุดปลายได้พิสูจน์ว่าไม่น่าเชื่อถือQPCR ในเวลาจริงปรากฏขึ้นเพื่อตอบสนองความต้องการในการปรับปริมาณที่แข็งแรงขณะที่ PCR จุดสิ้นยังคงมีประโยชน์เป็นหลักในการขยายชิ้นส่วน DNA ที่เฉพาะเจาะจงสําหรับการเรียงลําดับ, การคลอน และการใช้งานชีววิทยาโมเลกุลอื่น ๆ
เทคโนโลยีนี้วัดสารประกอบของ DNA หลังจากแต่ละวงการ โดยใช้สารสีหลอดแสงที่ผูกกับผลิตภัณฑ์ PCR (amplicons) ความเข้มข้นของหลอดแสงเชื่อมโยงตรงกับปริมาณ ampliconที่อนุญาตให้มีปริมาณปริมาณแบบเบื้องต้นโดยการติดตามการเปลี่ยนแปลงสัญญาณเครื่องสื่อแสงสว่างทั่วไปประกอบด้วย:
อุปกรณ์พิเศษรวมวงจรความร้อนกับการสแกนแสงสว่าง เพื่อสร้างเส้นโค้งการขยาย (รูป 1) ที่แสดงความเข้มข้นของแสงสว่างกับจํานวนวงจรแสดงถึงการสะสมผลิตภัณฑ์ตลอดกระบวนการ PCR.
เทคโนโลยีนี้ได้กลายเป็นมาตรฐานทองคําสําหรับการตรวจหาและปรับปริมาณ DNA/RNA โดยสามารถให้ความแม่นยําถึงสองเท่า โดยมีช่วงความเคลื่อนไหวที่กว้างถึง 6-8 ระดับขนาด
โปรต็อกอล PCR สภาพจริงแบบมาตรฐานใช้ 40 รอบ ซึ่งแต่ละรอบประกอบด้วย:
อุณหภูมิสูง (โดยทั่วไป 95 ° C) จะละลาย DNA ที่มีสายใยสองสายเป็นสายใยเดียวในขณะที่ทําลายโครงสร้างชั้นสอง โมเดลที่อุดมไปด้วย GC อาจต้องใช้เวลาการลดความอ่อนแอ
ลําดับที่เติมเต็มกันกระจายพันธุ์กันในอุณหภูมิ 5 °C ต่ํากว่าอุณหภูมิการละลายของพิมพ์ (Tm)
DNA polymerase ทํางานได้ดีที่สุดในอุณหภูมิ 70-72 °C โดยขยายพารมเมอร์ในอัตราสูงถึง 100 เบส/วินาที สําหรับแอมพลิคอนขนาดเล็ก ขั้นตอนนี้มักรวมกับการผสมผสานที่ 60 °C
แนวทางนี้เป็นการถ่ายทอด RNA กลับเป็น cDNA โดยใช้ reverse transcriptase (RT) กับ random, oligo ((dT) หรือ primers ที่เฉพาะพันธุกรรมประมาณ 10% ของ cDNA จากนั้นจะโอนไปยังหลอดแยกสําหรับ PCR ในเวลาจริงข้อดีประกอบด้วย
การรวมการสังเคราะห์ cDNA และ PCR ในท่อเดียวลดความเสี่ยงของการติดเชื้อและความผิดพลาดในการจัดการทําให้มันเหมาะสมสําหรับการใช้งานที่มีผลิตสูง.
PCR ในเวลาจริงมีหน้าที่สําคัญใน:
เทคโนโลยีใหม่ๆ เช่น PCR ดิจิทัล และการวิเคราะห์ละลายความละเอียดสูง สัญญาที่จะขยายการใช้งานในเวลาจริงของ PCR เครื่องมือรุ่นใหม่ให้ความรู้สึกสูงขึ้น ความเร็วและความสามารถในการวิเคราะห์ข้อมูลการใช้งานในอนาคตอาจรวมถึงการแพทย์บุคคลบุคคล การติดตามสิ่งแวดล้อมและการทดสอบความปลอดภัยของอาหาร ลงตําแหน่ง PCR ในเวลาจริงเป็นเครื่องมือที่จําเป็นสําหรับความก้าวหน้าทางวิทยาศาสตร์และสุขภาพประชาชน.
ผู้ติดต่อ: Ms. Lisa
Thai
