บล็อก เกี่ยวกับ การตีความหลักการทดสอบ RTPCR และความเสี่ยง COVID19

เนื่องจากการระบาดใหญ่ของ COVID-19 ยังคงนำเสนอความท้าทายระดับโลก การทดสอบ RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) ยังคงเป็นมาตรฐานทองคำสำหรับการวินิจฉัยการติดเชื้อ SARS-CoV-2 แต่มีกี่คนที่เข้าใจหลักการทางวิทยาศาสตร์เบื้องหลังเครื่องมือวินิจฉัยที่สำคัญนี้อย่างแท้จริง? บทความนี้ให้คำอธิบายเชิงลึกแต่เข้าถึงได้ง่ายเกี่ยวกับการทดสอบ RT-PCR ซึ่งช่วยให้ทั้งผู้เชี่ยวชาญทางการแพทย์และประชาชนทั่วไปเข้าใจเทคโนโลยีที่สำคัญนี้ได้ดีขึ้น

RT-PCR หรือ Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction เป็นเทคนิคชีววิทยาโมเลกุลที่มีความไวสูงและรวดเร็ว ซึ่งใช้ในการตรวจจับสารพันธุกรรมเฉพาะในตัวอย่าง สารพันธุกรรมนี้อาจมาจากมนุษย์ แบคทีเรีย หรือไวรัส เช่น SARS-CoV-2

เทคโนโลยีหลักเบื้องหลัง RT-PCR คือ PCR ซึ่งคิดค้นโดย Kary B. Mullis ในทศวรรษ 1980 (ได้รับรางวัลโนเบล) PCR ขยายและตรวจจับเป้าหมาย DNA เฉพาะ ต่อมามีการปรับปรุงเพื่อให้สามารถมองเห็นและวัดปริมาณเป้าหมาย DNA ได้แบบ "เรียลไทม์" ใน PCR แบบเรียลไทม์ ความเข้มของการเรืองแสงจากโพรบพิเศษสัมพันธ์กับปริมาณ DNA ที่ขยาย

อย่างไรก็ตาม PCR มาตรฐานตรวจจับได้เฉพาะ DNA เท่านั้น เนื่องจาก SARS-CoV-2 มีสารพันธุกรรม RNA การทดสอบจึงต้องใช้เอนไซม์ reverse transcriptase เพื่อเปลี่ยน RNA เป็น complementary DNA (cDNA) ขั้นตอนการถอดรหัสย้อนกลับนี้ รวมกับ PCR แบบเรียลไทม์ ทำให้ RT-PCR เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพในการตรวจจับไวรัส RNA เช่น SARS-CoV-2

การทำความเข้าใจ RT-PCR ต้องมีความรู้พื้นฐานเกี่ยวกับสารพันธุกรรม—คู่มือการใช้งานที่ควบคุมพฤติกรรมของเซลล์และไวรัส การอยู่รอด และการสืบพันธุ์ สารพันธุกรรมมีสองรูปแบบหลัก: DNA (deoxyribonucleic acid) และ RNA (ribonucleic acid) DNA มีโครงสร้างเป็นเกลียวคู่ ในขณะที่ RNA เป็นเกลียวเดี่ยว เพื่อวัตถุประสงค์ในการวินิจฉัย ความเสถียรที่มากกว่าของ DNA ทำให้เป็นที่ต้องการสำหรับการทดสอบโรคติดเชื้อ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง SARS-CoV-2 มีเพียง RNA เท่านั้น

ไวรัสทั้งหมดมีลักษณะร่วมกันคือต้องพึ่งพาเซลล์เจ้าบ้านเพื่อการอยู่รอดและการจำลองแบบ SARS-CoV-2 เช่นเดียวกับไวรัสอื่นๆ บุกรุกเซลล์ที่มีสุขภาพดีเพื่อสืบพันธุ์ เมื่อเกิดการติดเชื้อ ไวรัสจะปล่อย RNA และแย่งชิงเครื่องจักรของเซลล์เพื่อการจำลองแบบ ตราบใดที่สารพันธุกรรมของไวรัสยังคงอยู่ในเซลล์ RT-PCR สามารถตรวจจับการติดเชื้อ SARS-CoV-2 ได้

บุคลากรทางการแพทย์ที่ผ่านการฝึกอบรมจะเก็บตัวอย่างจากโพรงจมูก ซึ่งจะถูกนำไปใส่ในหลอดปลอดเชื้อที่มีตัวกลางขนส่งไวรัสเพื่อรักษาความสมบูรณ์ของไวรัส

ในห้องปฏิบัติการ นักวิจัยสกัด RNA โดยใช้ชุดทำความสะอาดเชิงพาณิชย์ จากนั้นตัวอย่าง RNA จะถูกเติมลงในส่วนผสมของปฏิกิริยาที่มีส่วนประกอบที่จำเป็นทั้งหมดสำหรับการทดสอบ รวมถึง DNA polymerase, reverse transcriptase, building blocks ของ DNA และโพรบและไพรเมอร์เรืองแสงเฉพาะ SARS-CoV-2

เนื่องจาก PCR ทำงานได้เฉพาะกับแม่แบบ DNA เท่านั้น reverse transcriptase จะเปลี่ยน RNA ทั้งหมดในตัวอย่าง (รวมถึง RNA ของมนุษย์ แบคทีเรีย โคโรนาไวรัสอื่นๆ และอาจเป็น RNA ของ SARS-CoV-2) ให้เป็น cDNA

กระบวนการนี้เกี่ยวข้องกับสามขั้นตอนที่ทำซ้ำ:

• การเสื่อมสภาพ: การให้ความร้อนแก่ DNA ถึง >90°C เป็นเวลาประมาณ 10 นาที จะแยก DNA สายคู่เป็นสายเดี่ยว
• การเชื่อมต่อไพรเมอร์: ชิ้นส่วน DNA สั้นๆ ที่ออกแบบมาเป็นพิเศษ (ไพรเมอร์) จะติดกับเป้าหมาย cDNA เฉพาะของ SARS-CoV-2 ที่อุณหภูมิต่ำกว่า เป้าหมายยีน COVID-19 ทั่วไป ได้แก่ RNA-dependent RNA polymerase (RdRP), ORF1ab, ยีน S (โปรตีนหนาม), ยีน N (นิวคลีโอแคปซิด) และยีน E (ซองจดหมาย)
• การขยาย: DNA polymerase ใช้ไพรเมอร์เป็นจุดเริ่มต้นในการสร้างสำเนาที่เหมือนกันของส่วน DNA เป้าหมาย

กระบวนการนี้ทำซ้ำโดยทั่วไป 40 ครั้ง ทำให้ DNA เป้าหมายเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่าในแต่ละรอบ โพรบเรืองแสงจะจับกับปลายน้ำของไพรเมอร์ ปล่อยสัญญาณที่ตรวจจับได้ในแต่ละการขยาย DNA การเพิ่มขึ้นของ DNA เป้าหมายสัมพันธ์กับความเข้มของการเรืองแสงที่เพิ่มขึ้น

ข้อมูลการเรืองแสงสร้างค่า "Cycle Threshold" (Ct)—จำนวนรอบที่จำเป็นเพื่อให้สัญญาณเกินระดับพื้นหลัง ตัวอย่างที่มี DNA เป้าหมายมากกว่าจะขยายเร็วขึ้น โดยต้องใช้รอบน้อยลง (ค่า Ct ต่ำกว่า) ในทางกลับกัน DNA เป้าหมายที่หายากต้องใช้รอบมากขึ้น (ค่า Ct สูงกว่า)

ค่า Ct ให้ข้อมูลสำคัญเกี่ยวกับปริมาณไวรัส ค่า Ct ที่ต่ำกว่าบ่งบอกถึงปริมาณจีโนมไวรัสที่สูงกว่า ในขณะที่ค่าที่สูงกว่าบ่งบอกถึงปริมาณที่ต่ำกว่า ผู้ให้บริการด้านการดูแลสุขภาพรวมค่า Ct กับอาการทางคลินิกและประวัติเพื่อประเมินระยะของโรค ค่า Ct แบบอนุกรมจากการทดสอบซ้ำช่วยติดตามความก้าวหน้าของโรคและทำนายการฟื้นตัว นักติดตามผู้ติดต่อยังใช้ค่า Ct เพื่อจัดลำดับความสำคัญของผู้ป่วยที่มีปริมาณไวรัสสูงสุด (และดังนั้นจึงมีความเสี่ยงในการแพร่เชื้อมากที่สุด)

• ปริมาณไวรัส: ค่า Ct สัมพันธ์ผกผันกับปริมาณไวรัส—Ct ที่ต่ำกว่าหมายถึงมีไวรัสอยู่มากกว่า
• ระยะของโรค: การติดเชื้อในระยะแรกมักจะแสดงปริมาณไวรัสสูง (Ct ต่ำ) ในขณะที่ระยะหลังจะแสดงปริมาณที่ลดลง (Ct ที่เพิ่มขึ้น) เมื่อระบบภูมิคุ้มกันกำจัดการติดเชื้อ
• ความเสี่ยงในการแพร่เชื้อ: ปริมาณไวรัสที่สูงขึ้น (ค่า Ct ที่ต่ำกว่า) บ่งบอกถึงศักยภาพในการแพร่เชื้อที่มากขึ้น ซึ่งรับประกันมาตรการแยกโรคที่เข้มงวดกว่า

แม้ว่าจะเป็นมาตรฐานทองคำในการวินิจฉัย COVID-19 แต่ RT-PCR ก็มีข้อจำกัด:

• ผลลบปลอม: การสุ่มตัวอย่างที่ไม่เหมาะสม ปริมาณไวรัสต่ำ หรือการทดสอบในระยะแรกอาจให้ผลลบแม้จะมีการติดเชื้อจริง
• ผลบวกปลอม: ผลบวกที่อาจเกิดขึ้นได้ยากแต่เป็นไปได้โดยไม่มีการติดเชื้อจริง
• ความท้าทายในการทำให้เป็นมาตรฐาน: ห้องปฏิบัติการและแพลตฟอร์มต่างๆ อาจใช้เกณฑ์ Ct ที่แตกต่างกัน ทำให้การเปรียบเทียบมีความซับซ้อน

การทดสอบ RT-PCR ยังคงมีความจำเป็นสำหรับการวินิจฉัย COVID-19 โดยการตรวจจับสารพันธุกรรม SARS-CoV-2 ค่า Ct ทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้ที่สำคัญของปริมาณไวรัส ความก้าวหน้าของโรค และความเสี่ยงในการแพร่เชื้อ อย่างไรก็ตาม ข้อจำกัดในการทดสอบจำเป็นต้องรวมผลลัพธ์กับการประเมินทางคลินิกเพื่อการวินิจฉัยและการจัดการที่ถูกต้อง