บล็อก เกี่ยวกับ นักวิทยาศาสตร์ พัฒนา เทคนิค Qpcr สําหรับ การ วิเคราะห์ การ อธิบาย เจน

ลองจินตนาการว่าถือกุญแจที่ติดตามการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของพันธุกรรมในเซลล์ได้อย่างแม่นยํา QPCR (real-time quantitative PCR) เป็นเครื่องมือที่น่าทึ่งเทคนิคโมเลกุลที่ทันสมัยนี้ ไม่เพียงแต่ตรวจจับรหัส DNA แต่ยังวัดจํานวนของรหัส DNA ด้วยความแม่นยําการวิจัยพันธุกรรมและการวินิจฉัย

ไม่เหมือนกับ PCR แบบดั้งเดิมที่วิเคราะห์ผลหลังจากการขยาย, qPCR ติดตามการจําลอง DNA ในเวลาจริงผ่านสัญญาณแสงสว่าง.ความแตกต่างนี้ทําให้ qPCR (ที่เรียกว่า PCR ณ เวลาจริงปริมาณ) เป็นเครื่องมือที่มีพลังในการวิเคราะห์แบบไดนามิก.

PCR การถ่ายทอดกลับ (RT-PCR) มีวัตถุประสงค์ที่แตกต่างกัน โดยการขยายเป้าหมาย RNA โดยการแปลงมันเป็น cDNA ก่อนqPCR มีความเชี่ยวชาญในเรื่องการปรับปริมาณในเวลาจริง.

SYBR โปรเทคโนโลยีสีเขียวสะท้อนวงวัฏจักร 3 ขั้นตอนของ PCR แบบดั้งเดิม แต่รวมสารสีหลอดที่ผูก DNA ทั้งหมดสีสีนี้ปล่อยแสงสว่างที่สามารถวัดได้ สัดส่วนกับปริมาณของธาตุ DNA.

ขณะที่มีประสิทธิภาพต่อราคา การขาดความเฉพาะของ SYBR Green ต้องการการวิเคราะห์เส้นโค้งการละลายเพื่อแยกการขยายเป้าหมายจากผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะอย่างเช่นพาริมเมอร์

ระบบ TaqMan ใช้ซอนด์ oligonucleotide กับเครื่องสื่อสารและเครื่องดับแสงสว่างโซนด์เหล่านี้ยึดลําดับเป้าหมายโดยเฉพาะ และปล่อยแสงสว่างเมื่อแยกโดยกิจกรรม exonuclease 5'-3' ของ Taq polymerase ระหว่างการขยาย.

แม้จะแพงกว่า แต่ TaqMan มีข้อดีสําคัญ

• ความเฉพาะเจาะจงเพิ่มเติม:โซนส์เชื่อมต่อลําดับเป้าหมายเท่านั้น ทําให้สัญญาณเท็จหมด
• ความสามารถหลายสาย:การตรวจพบเป้าหมายหลายอย่างพร้อมกัน โดยใช้เครื่องตรวจสอบที่มีเครื่องหมายที่แตกต่างกัน

ผลการตรวจ qPCR ปกติจะแสดงเป็นเส้นโค้งการขยายที่แสดงแสงสว่างต่อกับวงจรความร้อนวงจรขั้นต่ํา (Ct) ช่วงที่แสงสว่างเกินพื้นหลังค่า Ct ที่ต่ํากว่าสะท้อนถึงปริมาณเริ่มต้นที่สูงกว่า

ความพยายามในการมาตรฐานผ่านแนวทาง MIQE (ข้อมูลขั้นต่ําสําหรับการทดลอง PCR ในเวลาจริงจํานวน) รับประกันความสามารถในการผลิตแบบทดลองโดยบังคับการรายงานโปรโตคอลที่ครบถ้วน

ก่อนการตีความข้อมูล การทดสอบ qPCR จําเป็นต้องรับรองว่า:

1. ประสิทธิภาพการปฏิกิริยา:ในทางอุดมสมบูรณ์ 90-110% คํานวณผ่านการวิเคราะห์ความชันของเส้นโค้งมาตรฐาน
2. ความเฉพาะ:ยืนยันผ่านการวิเคราะห์เส้นโค้งการละลายระบุจุดสูงของการกระตุ้นเดียว

กําหนดจํานวนตัวสําเนาเป้าหมายโดยการเปรียบเทียบค่า Ct ตัวอย่างกับเส้นโค้งมาตรฐานของปริมาณความเข้มข้นที่รู้จัก

เปรียบเทียบการแสดงออกของยีนระหว่างตัวอย่างโดยใช้ยีนอ้างอิง วิธี ΔΔCt (สําหรับปฏิกิริยาประสิทธิภาพ 95-105%) หรือวิธี Pfaffl (สําหรับประสิทธิภาพแปร) คํานวณการเปลี่ยนแปลงการแสดงออก

วิธีการเหล่านี้ทําให้นักวิจัยสามารถวัดความแตกต่างทางพันธุกรรมได้อย่างแม่นยํา ทําให้สาขาต่างๆ จากการวิจัยมะเร็งไปจนถึงการติดตามโรคติดต่อได้ก้าวหน้า